تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تقنية معملية متطورة تستخدم على نطاق واسع في الطب والمجالات العلمية الأخرى. أصبحت تشخيصات تفاعل البوليميراز المتسلسل في وقت واحد طفرة حقيقية في العلم.
الوصف
الكمي PCR هو نوع من PCR في الوقت الحقيقي.
يُفهم هذا على أنه متغير من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، حيث يتم تسجيل حركية التفاعل باستمرار ، مما يجعل من الممكن تقييم محتوى متواليات نوكليوتيد DNA معينة في خليط جزيئي معقد.
ستتم مناقشة طريقة PCR الكمية بمزيد من التفصيل أدناه.
جوهر التحليل
غالبًا ما تُستخدم الأساليب الثقافية والمصلية بشكل خاص لتشخيص العدوى. تحت الأول ، يتم تحديد الأجسام المضادة لمسببات الأمراض المعدية في مصل الدم. في الثانية ، يتم استخدام مادة بيولوجية مأخوذة من شخص مريض لزرع وسط معين مناسب لنمو مستعمرات مسببات الأمراض. التشخيص في كليهماقد تستمر القضية لأيام أو أسابيع.
يمكن إجراء فحص PCR بمواد بيولوجية مختلفة يتم الحصول عليها من شخص مريض. الدم والوسائط والسوائل المرضية والفسيولوجية والبيولوجية الأخرى بمثابة عينات. يمكنك عمل بول أو براز تفاعل البوليميراز المتسلسل
يتم تشخيص العدوى غير النمطية والفيروسية غالبًا عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، حيث قد لا يكون من السهل تشخيصها بسبب الطبيعة المحددة للعملية المرضية التي تسببها. لتحديد مثل هذه العدوى ، يستغرق الأمر وقتًا يبدأ خلاله إنتاج الأجسام المضادة في الجسم ، ويتم تحديدها بواسطة الطرق المصلية. لكن هذا غير مقبول في بعض الحالات.
طريقة التنفيذ
طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل - الكشف المختبري عن العدوى في العينات المعزولة من المريض (في المختبر).
لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل ، يلزم وجود مجموعة من الكواشف الخاصة.
يتم إدخال مادة الاختبار في أنابيب الاختبار مع الكواشف. يتم وضع أنابيب الاختبار في جهاز خاص - مضخم PCR ، مصمم لتضخيم (زيادة عدد) شظايا الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المطلوب ، ويعمل مكبر الصوت PCR في الوضع الدوري. في أي دورة ، إذا كانت العينات تحتوي على تسلسل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي للعامل الممرض ، فإن المزيد والمزيد من نسخ جزيئات هذه الأحماض النووية تتراكم في المحلول. يمكنك تحديد وجود العامل الممرض وكميته في العينات.
أنواع PCR
يسمح لك التحليل النوعي بواسطة PCR بالحصول على النتيجة التالية:
- سلبي عندما لا يتم العثور على العامل الممرض في العينات ؛
- إيجابي إذا تم العثور على تسلسل في العينات التي تميز مسبب مرض معين.
مع نتيجة PCR إيجابية ، يمكننا التحدث بدقة 95 ٪ عن وجود عدوى تم تشخيصها. في الوقت نفسه ، تصل دقة مجموعات PCR المستخدمة لأغراض التشخيص إلى 100٪.
عادة ما يتم تحديد 5٪ من النتائج غير الصحيحة بواسطة العامل البشري. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي انتهاكات تقنية التحليل وتخزين الكواشف إلى تقليل دقة الدراسة بشكل كبير.
يحدد PCR الكمي مفهوم الحمل الفيروسي. من الممكن تحديد عدد مجموعات الحمض النووي الممرض في العينات المأخوذة من المريض.
شدة الإصابة تتناسب طرديا مع زيادة عددها. يمكنك أيضًا تحديد نجاح العلاج لتقليل الحمل الفيروسي.
تقديم للمواد الحيوية PCR
يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في العيادة ، بشكل رئيسي في الصباح. أثناء زيارة الطبيب ، سيتم إطلاع المريض على ما يجب أخذه: كشط ، مسحة ، بول أو دم. يمكن لـ PCR اكتشاف مسببات الأمراض بغض النظر عن مستوى تلوث المادة.
لإجراء تحليل إيجابي ، من الناحية النظرية ، لا يلزم وجود سوى مسببات مرض واحدة في العينات. في الممارسة العملية ، يحاولون خلق ظروف أكثر ملاءمة. هناك بعض التوصيات لهذا:
- إذا أخذوا كشط أو مسحة من الأعضاء التناسليةالأعضاء ، عليك الامتناع عن الجماع الحميم قبل الدراسة بثلاثة أيام ؛
- لا يمكنك الغسل بالأدوية المضادة للبكتيريا أو أن تغسل نفسك قبل التحليل ؛
- ثلاث ساعات قبل أخذ مسحة من مجرى البول ، عليك التحلي بالصبر وعدم إفراغ الأمعاء.
لا تتبع هذه القواعد عند التبرع بالدم.
كيف يتم تفسير نتائج التحليل الكمي PCR؟
التقييم الكمي للنتائج المتحصل عليها
في عدد من الحالات السريرية ، تظهر مشكلة فعالية العلاج و / أو ديناميات عملية علم الأمراض. هذه الأسئلة مهمة بشكل خاص عند فحص الأشخاص المصابين بعدوى مزمنة (فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد B و C). عند التشخيص ، فإنها تستند إلى حقيقة أن تراكم الأمبليكون (منتجات PCR) يتناسب مع وجود نسخ من الجين المطلوب في العينة التي تم تحليلها.
بالطبع ، مع الأخذ بعين الاعتبار نتائج PCR الكمية يتم عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام مع دراسة شدة إشارات PCR الخاصة. كذلك ، فإن الشرط الأساسي لإجراء تقييم كمي صحيح للنتائج التي تم الحصول عليها هو عينات تحكم إيجابية وموثوقة تحتوي على عدد معروف من نسخ الجين المطلوب (على سبيل المثال ، ألف نسخة من جين التهاب الكبد C لتفاعل PCR واحد). تسمح العديد من التخفيفات التسلسلية للتحكم الكمي بإنشاء منحنيات المعايرة واستخدامها لتقييم محتوى عمليات الإبادة السريرية في العينات السريرية.
في تعريف PCR الكمي ، كان الإنجاز الرئيسي هو الخلقتحقيقات الحمض النووي الفلورية التي تضاف إلى خليط التفاعل في وقت واحد باستخدام بادئات بسيطة وتسمح لك بتتبع عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت المناسب ، أي في الوقت الحقيقي PCR.
تشير منهجية TaqMan إلى توليف مجسات DNA الفلورية الخاصة بالجزء الأوسط من amplicon ولها ملصقان في نهاياتها. واحد منهم هو ملصق الفلورسنت ، والثاني هو جزيء تقطير لهذا الفلورة.
جهاز خاص ، وهو مزيج من مقياس التألق ومضخم الكتلة الحرارية ، يقوم بقياسات ثابتة للفلورة في كل أنبوب اختبار (مبدأ PCR في الوقت الحقيقي). بعد 20-40 دورة من PCR ، سيتم الحصول على منحنيات فردية لكل عينة. يمكن حساب عدد نسخ الجين المطلوب الموجود في عينة الاختبار من منحنيات المعايرة بعينات التحكم.
أيضًا ، من السمات المهمة لتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة طريقة الفلورسنت أنه لا توجد حاجة لفتح الأنابيب بخليط PCR عند أخذ النتائج في الاعتبار. هذا يقلل من احتمالية تلوث الغرفة بمنتجات التضخيم ، وليست هناك حاجة لتخصيص مناطق عمل خاصة للرحلان الكهربي.
ما الذي يظهره نص PCR الكمي؟
ما الذي يتم اكتشافه؟
من خلال طريقة مثل PCR الكمي ، تم العثور على تغييرات نوعية في الجينات: عمليات الإدراج والحذف والطفرات النقطية. لكن مع بعض الاضطرابات الوراثية ، تظهر الأعراض المقابلة استجابة لتغير في محتوى جينات معينة.
شكرايعطي التحليل الكمي نتيجة عددية ، غالبًا بوحدة دولية / مل. هذا يعني أنه في مليلتر واحد من عينة الاختبار ، تم العثور على عدد معين من نسخ الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي للممرض ، مقاسة بالوحدات الدولية.
اعتمادًا على حجم الإصابة ، يتم تشخيص شدة الإصابة. عادة ما يتم اختبار الدم لتحديد الحمل الفيروسي ، حيث تتحرك الفيروسات بحرية في الدم أثناء المرض.
الميزات
الكمي PCR في اختبار الدم له ميزتان.
- يتم إجراء التحليل في وجود مواد أولية أو ثلاثي فوسفات deoxyribonucleoside ، والتي تم تمييزها بعلامة الفلورسنت أو المشعة لتحديد محتوى منتج PCR بدقة.
- في عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإنهاء التفاعل مبكرًا قبل ظهور العديد من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل. هذا يرجع إلى حقيقة أنه في المرحلة النهائية من التشبع ، عندما يكون هناك الكثير من منتجات PCR ، يعمل كل من الإنزيم نفسه والركائز كحلقات تقييد لهذا التفاعل. لم تعد نهاية دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية في ظل هذه الظروف تتميز بمضاعفة عدد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتم تسوية الفروق الكمية الضئيلة بين العينات المختلفة ، والتي تم تحديدها بوضوح تام في المراحل المبكرة بعد المرور بسلسلة من دورات التفاعل
تكلفة تشخيص PCR
لأبحاث تفاعل البوليميراز المتسلسل تكلفة ، والتي تعتمد على نوع العدوى التي سيتم اختبارها ، وعلى منهجية التحليل ومواد الاختبار. لتحديد إصابة واحدة ، عليك الاستسلام للداخل200-800 روبل. يضاف أيضًا رسم لأخذ المواد الحيوية - حوالي 400 روبل.
