اللوني هي إحدى طرق فصل المواد. يتم استخدامه للتحليل النوعي والكمي اللاحق للخواص الفيزيائية والكيميائية للجسيمات الدقيقة. أحد أشكال هذه التقنية هو كروماتوغرافيا التقارب. إن فكرة التفريق بين مركبات البروتين باستخدام خاصية التقارب الجزيئي معروفة في العلم لعدة عقود. ومع ذلك ، فقد تم تطويره فقط في السنوات الأخيرة ، بعد إدخال مواد عالية المسامية محبة للماء تستخدم كمصفوفة. تسمح هذه الطريقة بحل كل من المشكلات التحليلية (فصل المواد وتحديدها) والمشكلات التحضيرية (التنقية والتركيز).
جوهر
كروماتوغرافيا التقارب (من الكلمة اللاتينية affinis - "المجاورة" ، "ذات الصلة") تعتمد على تفاعلات التقارب ، والتي هي تكوين روابط محددة للغاية بين جزيء مباعد (يجند أو مترافق) وجزيء مستهدف. هذه الآليات منتشرة بطبيعتها (اتصال وسطاء أو هرمونات ومستقبلات وأجسام مضادة والمستضدات ، تهجين عديد النوكليوتيدات وأنواع أخرى من العمليات). في الطب ، تم استخدام كروماتوغرافيا التقارب لأغراض عملية منذ عام 1951
يتم فصل المكونات على النحو التالي:
- محلول عامل يحتوي على المادة المراد عزلها يمر عبر المادة الماصة ؛
- يجند المودعة على مصفوفة المواد الماصة يحتفظ بهذه المادة ؛
- يتركز (تراكم) ؛
- استخلاص المادة المعزولة من المادة الماصة بغسلها بمذيب.
تسمح لك هذه الطريقة بعزل الخلايا بأكملها. الاختلاف عن كروماتوغرافيا الامتصاص التقليدي هو أن هناك ارتباطًا حيويًا قويًا للمكون المعزول بالمادة الماصة ، والذي يتميز بانتقائية عالية.
الممتزات
المواد التالية تستخدم كممتزات:
- مركبات جل تعتمد على الاغاروز ، وهو عديد السكاريد الذي تم الحصول عليه من أجار. الأكثر شيوعًا هي 3 أنواع: sepharose 4B و CL (agarose المتصالب) و affi-gel. التركيبة الأخيرة عبارة عن هلام معدل من الاغاروز و بولي أكريلاميد. لديها خمول بيولوجي أكبر ، مقاومة كيميائية وحرارية عالية.
- السيليكا (هلام السيليكا).
- زجاج
- بوليمرات عضوية.
لإزالة العوائق الميكانيكية أثناء ملامسة الترابط ، يتم استخدام مواد إضافية لفصله عن الناقل (الببتيدات ، ثنائي أمين ، بولي أمين ، قليل السكريات).
معدات
معدات كروماتوغرافيا التقارب تشمل الوحدات الرئيسية التالية:
- صهاريج تخزين للمرحلة المتنقلة (eluent) ؛
- مضخات الضغط العالي للإمداد المتوسط (غالبًا ترددية) ؛
- فلتر لتنظيف الشطف من الغبار ؛
- جهاز الجرعات ؛
- عمود كروماتوغرافي لفصل الخليط ؛
- كاشف للكشف عن المكونات المنفصلة التي تغادر العمود ؛
- مسجلات الكروماتوجرام ووحدة المعالجات الدقيقة (الكمبيوتر).
من أجل تقليل كمية الهواء المذاب ، يتم تمرير الهيليوم أولاً عبر الطور المتحرك. لتغيير تركيز eluent ، يتم تثبيت عدة مضخات يتحكم فيها المبرمج. الأعمدة الكروماتوغرافية مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ (لمتطلبات متزايدة لمقاومة التآكل) أو الزجاج (خيار عالمي) أو الأكريليك. للأغراض التحضيرية ، يمكن أن يختلف قطرها من 2 إلى 70 سم. في الكروماتوغرافيا التحليلية ، يتم استخدام الأعمدة الدقيقة التي يتراوح قطرها بين 10 و 150 ميكرومتر.
لزيادة حساسية أجهزة الكشف ، يتم إدخال الكواشف في الخليط ، مما يساهم في تكوين مواد تمتص المزيد من الأشعة في المنطقة فوق البنفسجية أو المرئية من الطيف.
المنهجية
هناك نوعان رئيسيان من كروماتوغرافيا تقارب السائل:
- عمود ، حيث يملأ العمود بمرحلة ثابتة ويمرر خليط من خلاله بتدفقإلينت. يمكن أن يحدث الانفصال تحت الضغط أو تحت الجاذبية
- طبقة رقيقة. يتحرك eluent على طول طبقة الممتزات المسطحة تحت تأثير القوى الشعرية. يتم وضع المادة الماصة على لوح زجاجي أو سيراميك أو قضيب كوارتز أو رقائق معدنية.
تشمل مراحل العمل الرئيسية:
- تحضير الممتزات ، تثبيت الترابط على الناقل ؛
- تغذية خليط الفصل إلى العمود الكروماتوغرافي ؛
- تحميل الطور المتحرك ، ربط المكون بواسطة يجند ؛
- استبدال المرحلة لعزل المادة المربوطة
الوجهة
يستخدم كروماتوغرافيا التقارب لعزل الأنواع التالية من المواد (يشار إلى نوع الترابط المستخدم بين قوسين):
- نظائرها من مثبطات الأنزيمية والركائز والعوامل المساعدة (الإنزيمات) ؛
- مواد عضوية بيولوجية مع علامات الغربة الجينية والفيروسات والخلايا (الأجسام المضادة) ؛
- كربوهيدرات ذات وزن جزيئي مرتفع ، بوليمرات أحادية السكاريد ، بروتينات سكرية (ليكتينات) ؛
- البروتينات النووية ، nucleotidyltransferases (الأحماض النووية) ؛
- مستقبلات ، نقل البروتينات (فيتامينات ، هرمونات) ؛
- بروتينات تتفاعل مع أغشية الخلايا (الخلايا).
تُستخدم هذه التقنية أيضًا للحصول على إنزيمات ثابتة ، وربطها بالسليلوز يسمح بإنتاج مواد ماصة للمناعة.
اللوني للبروتينات الرابطة للحمض النووي
يتم إجراء عزل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي باستخدامالهيبارين. هذا الجليكوزامينوجليكان قادر على ربط مجموعة واسعة من الجزيئات. يستخدم كروماتوجرافيا الانجذاب لبروتينات هذه المجموعة لعزل مواد مثل:
- عوامل بدء واستطالة الترجمة (تخليق جزيئات الحمض النووي والبروتينات) ؛
- قيود (إنزيمات تتعرف على تسلسلات معينة في الحمض النووي مزدوج الشريطة) ؛
- ligases DNA و polymerases (إنزيمات تحفز انضمام جزيئين لتشكيل رابطة كيميائية جديدة وتشارك في تكرار الحمض النووي) ؛
- مثبطات الأنزيم البروتيني السيرين التي تلعب دورًا مهمًا في عمليات المناعة والالتهابات ؛
- عوامل النمو: الخلايا الليفية ، شوان ، البطانية ؛
- بروتينات المصفوفة خارج الخلية
- مستقبلات الهرمون
- بروتينات دهنية.
كرامة
هذه الطريقة هي الأكثر تحديدًا لعزل المركبات التفاعلية (الإنزيمات والتجمعات الكبيرة - الفيروسات). ومع ذلك ، لا يتم استخدامه فقط لعزل المواد النشطة بيولوجيا.
الكشف عن الأجسام المضادة بكميات صغيرة ، التقييم الكمي لحمض بولي أدنيليك ، التحديد السريع للكتل الجزيئية لنزعة الهيدروجين ، إزالة بعض الملوثات ، دراسة حركية تنشيط الشكل الخامل من التربسين ، التركيب الجزيئي للإنسان الإنترفيرون - هذه ليست القائمة الكاملة للدراسات التي يستخدم فيها التقارب. الاستخدام في العيادة يرجع لمميزاتها مثل:
- قدرة تنظيف فعالةالبروتينات والسكريات والأحماض النووية. تختلف اختلافًا طفيفًا في خصائصها الفيزيائية والكيميائية وتفقد النشاط أثناء التحلل المائي والتمسخ وأنواع العلاج الأخرى المستخدمة في طرق أخرى.
- سرعة فصل المواد ، الطبيعة الديناميكية للعملية
- لا حاجة لتنقية إنزيم خاص وتجانس انزيم الانزيم لتحديد ثوابت التفكك.
- قادرة على فصل مجموعة واسعة من المواد.
- استهلاك منخفض للروابط
- إمكانية فصل المواد بكميات كبيرة.
- عملية عكسية لربط الجزيئات البيولوجية.
يمكن دمج هذه التقنية مع الآخرين ، لفرض مجال إضافي (الجاذبية ، الكهرومغناطيسية). هذا يسمح لك بتوسيع القدرات التقنية للكروماتوغرافيا.
الهندسة الأنزيمية
بفضل هذه الطريقة ، بدأ التطوير النشط لفرع جديد للتكنولوجيا الحيوية - هندسة الإنزيم.
يتمتع كروماتوغرافيا التقارب لعزل الإنزيم بالمزايا التالية:
- الحصول على الإنزيمات بكميات كبيرة نتيجة لقصر الوقت نتيجة لذلك - انخفاض سعرها ؛
- يمكن أن يؤدي تجميد الإنزيمات إلى توسيع نطاق تطبيقها بشكل كبير في الطب والصناعة ؛
- إن ارتباط الإنزيمات بالدعم الصلب غير القابل للذوبان يجعل من الممكن دراسة تأثير البيئة المكروية واتجاه التفاعلات ، والتي تلعب دورًا مهمًا في العمليات الطبيعية والفسيولوجية.
